1、 蛋白与膜的结合原理

蛋白与膜的结合原理， 已知的结合力包括疏水作用力\H键\静电作用力等，确切的结合原理并不明确，主要靠假说来支撑。主要有两种假说:

（1） 首先两者靠静电作用力结合， 然后靠H键和疏水作用来维持长时间结合。

（2） 首先两者靠疏水作用结合， 然后靠静电作用来维持长时间结合。

两条假说， 都表明其结合过程分为两步， 首先结合和后面长时间结合。由于结合原理的不明确性， 导致在这方面的工作非常依赖实践经验。

 

2、 膜对结合的影响

（1）膜孔径

有些技术人员倾向使用膜孔径来区分不同的膜，但是请注意这只仅仅限于同一厂家的产品，如果是不同厂家的产品，这种比较是无意义的。膜孔径与层析速度的关系，已在上文描述。

随着膜孔径减小，膜的实际可用表面积递增，膜结合蛋白的量也递增。估量表面积的参数为表面积比率(实际可用表面积与所用膜平面积的比率)。

另外， 膜孔径越小，层析速度也越小，那么金标复合物通过T线的时间也就越长，反应也就越充分。

综合以上两点，结论为膜孔径越小灵敏度越高。但是同时也减慢了跑板速度，增加了非特异性结合的机会，也就是假阳性越高。所以要按照试验结果挑选适合实际项目的膜，找到合适的平衡点。

（2）不同厂家的膜差异

这个差异主要来源于两点：

A、生产膜时，使用的聚合物和表面活性剂的来源，类型，数量不同。同理，在膜处理中这两类物质一般会对性能产生较大影响。

B、处理过程不同。

 

3、 生物原料，缓冲溶液的试剂和配方

（1）生物原料

 作为CT线的生物原料使用情况各异，所以这里只做略述。

首先，单克隆抗体与膜的结合优于多克隆抗体， 主要时由于多克隆抗体有很多不同的表面位点， 而各位点与膜的最佳结合条件都有细微的差别， 毫无疑问就增加了优化难度。

其次，分子量越大，蛋白越难结合到固相材料上。

（2）缓冲液

大家最关心的可能就是希望获得一个性能优良的配方，包括缓冲液，封闭液等等处理溶液配方。

其实我也无法提供给你一个万用配方清单。因为不同的反应体系需要不同的配方来支持， 而不同机构的反应体系又有差异。想获”鱼”先学”渔”。为了不误导大家，我在下面涉及到配方的问题上，仅提供思路，具体配方请自己摸索。

缓冲液的构成一般是: PBS(或其他缓冲体系)+作用物质(针对某一特定问题)+PH调整。我在参考过以前的各种资料后，个人意见为配方原则为宜简不宜繁，根据自己的需要添加作用物质，原来的很多需要添加的作用物质，由于膜制造技术的改进已经不再需要。

推荐的缓冲体系为0.01M PBS PH7-7.2, 该缓冲体系对多种抗原抗体都有良好的适应性。

作用物质的情况大致罗列如下:

少量NACL,减少信号强度，消假阳。

有机醇(甲醇，异丙醇等)，润湿膜，减少膜带有的静电，利于结合包被。个人不推荐，因制膜工艺改进。

表面活性剂(TW20,TX100)，增加亲水力，可避免线条中空现象，也可增色。

糖保护剂，减缓老化速度，也可以增加亲水力同上。

调PH到某个位置，可以消假阳。

 

4、 点样环境

环境湿度对点膜过程非常重要。最佳湿度一般在45-65%。

湿度过低，膜上容易聚集静电荷，点膜容易出现散点，导致测试会出现疏水斑。

湿度过高，膜上毛细作用加强，点膜容易引起CT线变宽甚至扩散。

为了保证点样时膜湿度的均一性，一般在点样前把膜放到该湿度条件下平衡一段时间。

 

5、 点样仪器与膜面情况的关系

目前有两种点样方式，划膜式和非接触点膜式。非接触点膜式优于划膜式，进口划膜式优于国产划膜式。

因划膜式为软管将抗体划到膜表面，而膜本身的物理性质为软脆，划管会在其表面留下印痕。进口的划膜机由于使用的材料和控制系统较好，所以留下的划痕较轻，而国产仪器较差，留下的划痕也就比较严重。划痕容易对层析的金标复合物形成阻力，导致假阳性。同时容易出现跑板时在T线位置出现若有若无一条细线(鬼线)，而跑板结束后鬼线消失的奇怪现象。

 

6、 膜的宽度与点样位置

膜的宽度一般有18mm(or 20mm)和25mm两种， 分别使用在做测试条和做测试板上。

然而，不同的T线点样位置将带来不同的灵敏度。点样位置上移，金标复合物通过T线位置时速度变慢，反应时间增加，灵敏度升高。反之灵敏度降低。这个方法可以用来改变灵敏度和消除假阳性。

 

7、 溶液在膜上的扩散

溶液在膜上的点样量一般情况下为1ul/cm.

溶液在膜上的扩散是趋向两端的，喷点上去的是均匀的抗体溶液，但当干燥时线条边缘的干燥速度高于中间，中间的抗体会不断向两边扩散，所以干燥后抗体是向线条的两端聚集的。一般情况下不影响你的试验。如果你发现线条出现两端红，中间淡的现象，就要考虑这个问题了。可以加如上面说的作用物质来解决。

 

8、 点膜前后的封闭作用

从供应商处购买回的膜基本上都是已经优化处理好的，直接点膜就可使用。然而我们还是经常会遇到关于封闭的讨论。

其实封闭不象大家认为的那样，一封闭什么问题都解决了。老问题走了新问题又来了，而且更麻烦，我要说的是慎用封闭。

我极其反对点膜前封闭的做法。原因为厂家在生产膜时候，各种配方是混合加入原浆的。而点膜前封闭时要将膜浸泡在封闭液内，必然扰乱了膜内正常的物质分布。由此引发了许多问题，也降低了工作效率。也有厂家遇到不封闭就无法包被上膜的问题，其实可以通过其他办法来解决，封闭必然是下测。

我经常使用的封闭手法有两种。

流动封闭，将作用物质处理在样品垫上。

膜上定点封闭，将作用物质配成溶液喷点在膜的特定位置上。该方法需要使用BIODOT的AIRJET喷头。可以将不合格的半成品大板重新复活。

只要是将封闭做在了膜上，就必然会对产品的稳定性造成影响。具体的影响程度要通过稳定性测试来评判。

 

9、 膜的储存

刚生产出的膜一般含有5-10%的水分。关于膜的老化机理，有个理论支持，不过争议比较大。理论认为:膜的老化是因为膜上的水分蒸发，使膜变得疏水，带电荷并变脆。储存膜一般要求是避光，密封。过干或过湿都不利。在这种保存条件下，一般可以放置两年。但是如果膜上做了封闭处理，就要根据具体试验情况来判断了。

有些膜由于生产工艺的问题，使用后灵敏度会在一段时间内发生变化，遇到这种问题，就需要在点膜后放置一段时间，待稳定后方可进入调试生产。